OBJEKTIF :
Ujian ini dijalankan dalam pendiagnosan kes anemia yang disebabkan intracellular defect seperti Hereditary spherocytosis.
TEORI :
Dinding sel darah merah ( SDM ) merupakan membran semi-permeable dan SDM bertindak sebagai satu osmometer. SDM adalah seimbang ketika berada dalam air iaitu air tidak akan masuk atau keluar dari menbran sel. Apabila SDM diampai di dalam larutan salin yang isotonik, SDM akan menyerap air, kembang dan pecah ( hemolisis ). Sel sferosit akan pecah lebih cepat daripada SDM normal dan sel yang nipis dan rata ( target sel) mempunyai ketahanan yang lebih tinggi daripada normal.
.
PRINSIP :
Dalam ujian ini, darah diampai dalam beberapa cairan salin yang
UJIAN mempunyai kepekatan yang berlainan dan dieram pada suhu bilik Selama ½ jam. Hemolisis yang berlaku akan disukat dengan membaca absorbans supernatannya melalui spektrofometer dan kemudian lakarkan grafnya.
REAGEN / PERALATAN
a ) Bahan Kimia
i. Larutan simpanan 10% sodium klorida ( NaCI ) tampan
pH 7.4
· Keringkan NaCI dalam desikator selama 24 jam sebelum ditimbang.
· Sodium chloride ( gred analar ) 10.0 g
· Na2HPO4 2.731 g
· NaH2PO4 0.486 g
· Larutan bahan – bahan tersebut dalam air suling dan jadikan isipadu ke 200 ml.
· Simpan pada suhu 4°C.
ii. Larutan kerja 1% NaCI tampan pH 7.4
· Larutan 10% NaCI tampan pH 7.4 simpanan 10 ml
· Air suling 90 ml
iii. Normal salin isotonik
iv. Air suling
b ) Bahan biologi / spesimen
· Darah vena dalam antibekuan heparin
c ) Alat radas
· Pipet 10 ml
· Mikropipet 10 – 100 mL
· Tabung uji
· Kuvett
· Kertas graf
d ) Peralatan
· Spektrofometer
· Pengempar
PROSEDUR :
v Satu siri calitan ( 0.10% - 0.85% ) disediakan dari laruatn kerja 1% NaCI. Jumlah isipadu yang sesuia bergantung kepada spektrofometer yang digunakan.
o Jika jumlah isipadu yang sesuia adalah 8.0 ml, cairan – cairan seperti berikut disediakan :
| No. Tabung uji | % NaCI | 1% NaCI ( ml ) | Air suling ( ml ) | Jumlah kandungan ( ml ) | Bacaan absorban | % hemolisis |
| 1 | 0.85 | 6.8 | 1.2 | 8.0 | 0.000 | 0.0 |
| 2 | 0.75 | 6.0 | 2.0 | 8.0 | 0.081 | 8.6 |
| 3 | 0.65 | 5.2 | 2.08 | 8.0 | 0.339 | 35.9 |
| 4 | 0.60 | 4.8 | 3.2 | 8.0 | 0.387 | 41.0 |
| 5 | 0.55 | 4.4 | 3.6 | 8.0 | 0.849 | 89.9 |
| 6 | 0.50 | 4.0 | 4.0 | 8.0 | 0.624 | 66.1 |
| 7 | 0.45 | 3.6 | 4.4 | 8.0 | 0.649 | 68.8 |
| 8 | 0.40 | 3.2 | 4.8 | 8.0 | 0.667 | 70.7 |
| 9 | 0.35 | 2.8 | 5.2 | 8.0 | 0.644 | 68.2 |
| 10 | 0.30 | 2.4 | 5.6 | 8.0 | 0.648 | 68.6 |
| 11 | 0.25 | 2.0 | 6.0 | 8.0 | 0.658 | 69.7 |
| 12 | 0.20 | 1.6 | 6.4 | 8.0 | 0.651 | 69.0 |
| 13 | 0.15 | 1.2 | 6.8 | 8.0 | 0.723 | 76.6 |
| 14 | 0.10 | 0.8 | 7.2 | 8.0 | 0.944 | 100 |
v Spesimen darah disebatikan dengan sempurna dan 0.05 ml
( 50 mL ) dipipetkan atau pipetkan 2 – 3 titik ke dalam setiap
tabung uji dengan menggunakan pipet Pasteur dan disebatikan dengan cermat.
v Tabung uji tersebut dibiarkan selama 30 minit pada suhu bili.
v Dengan kelajuan 2000 psm emparkan selama 5 minit.
v Bacaan absorban supernatan diambil di spektrofometer
( 540 nm ) dengan menggunakan salin isotonik atau tabung uji no. 1 sebagai kosong ( blank ) atau 0.5% hemolisis dan tabung uji no. 14 atau 10% NaCI sebagai 100% hemolisis.
v % hemolisis dikirakan dalam setiap tabung uji dan graf dilakarkan dengan menggunakan kertas graf.
KEPUTUSAN :
| No. Tabung uji | Bacaan absorban | % hemolisis |
| 1 | 0.000 | 0.0 |
| 2 | 0.081 | 8.6 |
| 3 | 0.339 | 35.9 |
| 4 | 0.387 | 41.0 |
| 5 | 0.849 | 89.9 |
| 6 | 0.624 | 66.1 |
| 7 | 0.649 | 68.8 |
| 8 | 0.667 | 70.7 |
| 9 | 0.644 | 68.2 |
| 10 | 0.648 | 68.6 |
| 11 | 0.658 | 69.7 |
| 12 | 0.651 | 69.0 |
| 13 | 0.723 | 76.6 |
| 14 | 0.994 | 100 |
Ø Pengiraan :
% hemolisis = Bacaan absorban supernatant X 100
Bacaan absorban 100% hemolisis
Perbincangan :
Ø Berdasarkan kepada keputusan yang diperolehi, kami telah memperolehi graf Hereditay Spherocytosis ( HS ). Graf yang diperolehi adalah ke kanan dari julat normal. Ini disebabkan oleh sample darah yang digunakan adalah sampel lama. Sel-sel darah dalam sampel ini mempunyai ketahanan yang kurang yang menyebabakan sel-sel darah ini hemolisis.
Ø Terdapat beberapa ralat yang menyebabkan graf yang diperolehi adalah kekanan dari julat normal iaitu proses pengambilan bahan kimia menggunakan pipet lebih atau kurang dari sukatan yang telah ditetapkan. Selain itu, kuvet yang digunakan adalah tidak bersih.
Kesimpulan :
Ø Graf yang diperolehi adalah kekanan dari graf normal iaitu graf Hereditag Spherocytosis ( HS ).
SOALAN :
1) Bincangkan jika keputusan ujian sekiranya graf yang diperolehi bergerak ke kanan dengan julat normal?
- kerana sample darah yang digunakan telah lama,sel-sel darah hemolisis dan dan sel darah mempunyai ketahanan yang kurang
2) Apakah ralat-ralat yang boleh mempengaruhi keputusan ujian dan bagaimana cara untuk memastikan bacaan absorban yang diperolehi tidak dipengaruhi oleh faktor ralat ?
- pengambilan sample yang salah
- menggunakan kuvet yang tidak bersih
