WESTER BLOT IMMUNOASSAY
PENGENALAN
Diperlukan untuk mengesan antibodi yang sangat spesifik. Kaedah ini berdasarkan pemisahan protein major agen infeksi secara elektroforesis dalam gel agarose. Suspensi bakteria yang mengandungi antibodi diletakkan di satu penghujung agar dan dengan pengaruh elektrik protein itu bermigrasi melalui gel agar.
PRINSIP
Untuk melakukan ujian ini, jalur dieramkan dengan serum pesakit yang telah dicairkan. Antibodi yang spesifik akan mengikat dengan nuklear neuron pada jalur. Selepas membasuh jalur, pengeraman dilakukan mengunakan konjugat A dan konjugat B, jalur dibasuh dan dieram bersama substrat enzim. Anti-Hu, anti-Yo dan anti-Ri akan mengalami reaksi positif dimana warna biru-ungu akan kelihatan.
REAGEN DAN BAHAN
· 1 x 20 Western Blot Strips
· 1 x 120 μl *anti-Hu/Yo Positive Control (purple vial cap)
· 1 x 120 μl *Negative Control (yellow vial cap).
· 1 Control Card
· 1 x 250 μl *Conjugate A (blue vial cap)
· 1 x 250 μl *Conjugate B (white vial cap)
· 1 x 60 ml *Serum Diluent
· 1 x 25 ml Enzyme Substrate (amber bottle)
· 1 vial *Powdered Wash Buffer; reconstitute to one liter with deionized or distilled water.
· 3 Assay trays
· 2 Report Forms *Contains <0.1% NaN3
· 1000 ml silinder penyukat
· forsep Filter
· kertas penyerap atau tuala kertas
· Deionized water atau suling
· Pipet 10 hingga 1000 μl
· pipet pakai buang
· Jam randik
PROSEDUR
1. Mengunakan forsep, tempatkan strips berlabel dalam telaga di dulang assay.
2. Pipetkan 1.0 ml serum kedalam setiap telaga
3. Pipetkan 10 μl kawalan positif dan negatif serta sampel pesakit kedalam telaga yang sesuai untuk mendapatkan pencairan 1:101. Eram 60 minit pada suhu bilik.
4. Aspirat larutan sampel kedalam bekas buangan. Basuh jalur dengan larutan pemampan Buffer. Basuh kira-kira 5minit dan aspirat dibuang kedalam bekas buangan. Ulang 2X.
5. Pipetkan 1.0 ml serum di ikuti oleh 10 μl konjugat A kedalam telaga. Eram 30 minit pada suhu bilik.
6. Ulangi langkah 4
7. Pipetkan 1.0 ml serum diikuti oleh 10 μl konjugat B ke dalam telaga. Eram 30 minit pada suhu bilik.
8. Ulangi langkah 4
9. Pipetkan 1.0 ml substrat ke dalam setiap telaga dan eram selama 10 minit pada suhu bilik.
10. Ternyahion (2X)
11. Mengunakan forsep, keluarkan jalur dari dulang assay dan letakkan perlahan-lahan diatas kertas penyerap. Biarkan kering selama 15—20 minit.
KEPUTUSAN :
Virus yang dapat dikesan ialah HSV 1 dan 2 serta HIV
PCR ( POLYMERASE CHAIN REACTION )
PENGENALAN
Kaedah ini menggabungkan prinsip penghibridan asid nukleik komplementari dan replikasi asid nukleik melalui beberapa kitaran. PCR melibatkan 30-50 kitaran dengan setiap kitaran menggabungkan 3 turutan reaksi iaitu denaturasi, annealing dan extension. DNA yang melalui proses PCR kemudiannya dilakukan elektroforesis seterusnya menghasilkan jalur DNA.
PRINSIP
PCR digunakan untuk menguatkan kawasan tertentu pada DNA. Kaedah yang biasa digunakan ialah PCR menguatkan serpihan DNA antara 0.1 dan 10 (kb). Jumlah produk dikuatkan ditentukan atas substrat yang menghasilkan reaksi. PCR biasanya dijalankan dalam jumlah reaksi 10-200 μl dalam tiub reaksi kecil.
BAHAN DAN REAGEN
· 34.5 ul H2O
· 1.0 ul diluted DNA solution
· 14.0 ul Buffer mix (buffer, primers, MgCl2, and dNTPs)
· 0.5 ul Taq polymerase
· Divalent kation, ion magnesium atau mangan kation Monovalent ion kalium
· polimerase Taq atau DNA polimerase
· Deoxynucleoside triphosphates
Mesin automasi yang digunakan :
| Thermal cycler bagi PCR | Model lama dengan 3-suhu unit thermal cycler bagi PCR |
| | |
PROSEDUR
1. Sampel DNA dipanaskan untuk memisahkan dan dicampurkan dengan primers
2. Primers mengikat dengan DNA
3. Campuran tindakbalas dengan semua triphosphatase empat deoxynucleotide (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
4. DNA polimerase membantu memisahkan DNA pada suhu yang tinggi
5. Menggunakan perlatan automatik, kitaran replikasi boleh disiapkan dalam masa kurang daripada 5minit. Setiap 30 pusingan bermula sebagai molekul DNA tunggal yang telah dikuatkan lebih daripada 1 bilion salinan ( 230 = 1.02 x 109 )
Prosedur bergambar PCR
KEPUTUSAN
Kit ujian PCR
Membenarkan diagnosis awal penyakit malignan seperti leukemia dan limfoma. Membenarkan pengenalpastian mikroorganisma bukalan cultivable seperti bakteria, mycobacteria anaerobik, virus. Diagnostik dalam mikrobiologi bagi pengesanan agen berjangkit yang bukan patogenik daripada strain patogen menurut gen-gen tertentu.
RUJUKAN
1. Posner, JB. Paraneoplastic syndromes. Neuro Clinics; 9:919-936, 1991.
2. Dalmau JO, Posner JB. Paraneoplastic syndromes. Arch Neurol; 56: 405-408, 1999.
3. Dropcho EJ. Principles of Paraneoplastic syndromes. Ann NY Acad Sci; 841:246-261, 1998.
4. Drlicek M, Bianchi G, Boglium G, et. al. Antibodies of the anti-Yo and anti-Ri type in the absence of paraneoplastic
5. neurological syndromes: a long term survey of ovarian cancer patients. J. Neurol; 244: 85-89, 1997.
6. Bartlett, J. M. S.; Stirling, D. (2003). "A Short History of the Polymerase Chain Reaction". PCR Protocols. 226. pp. 3–6.
7. Saiki, R.; Scharf, S.; Faloona, F.; Mullis, K.; Horn, G.; Erlich, H.; Arnheim, N. (1985). "Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia". Science 230 (4732): 1350–1354.
8. Saiki, R.; Gelfand, D.; Stoffel, S.; Scharf, S.; Higuchi, R.; Horn, G.; Mullis, K.; Erlich, H. (1988). "Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase". Science 239 (4839): 487–491.
