OBJEKTIF :
Untuk mewarnakan slaid filem darah nipis dengan menggunakan
perwarnaan leishman.
TEORI :
Pewarnaan leishman adalah satu pewarnnaan yang mudah
disediakan, cepat dan proses fixing dan pencelupan berlaku serentak. Pewarnaan leishman adalah paling popular digunakan di makmal-makamal hematologi. Hemoglobin dalam darah merah yang bersifat alkali akan diwarnakan denagn warna eosin yang mempunyai pH yang berasid. Manakala sel darah putih yang bersifat berasid akan diwarnakan dengan warna hematoksilin yang mempunyai pH yang beralkali.
REAGEN /RADAS :
Ø Bahan Kimia
– Penyediaan bahan pewarna :
· bahan pewarna leishman : 0.2 gram
· methanol mutlak BDH : 100ml
· peralatan yang digunakan mestilah tertutup rapat untuk mencegah kekeringan dan penyerapan alkohol di udara.
· Larutkan 0.2 g serbuk pewarna leishman di dalam beberapa ml methanol di dalam lesung.
· Methanol di tambahkan sedikit demi sedikit semasa melarutkan serbuk pencelup.
· Bahan pencelup tadi di tuangkan ke dalam bekas yang lain.
· Proses ini diteruskan sehingga kesemua serbuk pencelup larut dalam methanol.
· Turas dan biarkan semalaman.
– Penyediaan larutan tampan phosphate pH 6.8 :
· disediakan sama ada dengan melarutkan pil-pil larutan tampan phosphate pH6.8 yang diperolehi secara komersial atau menyediakan larutan tampan phosphate 0.006m di makmal.
· Larutan A KH2P04 0.91gram
Air suling 100ml
· larutan B Na2HP04 0.95 gram
Air suling 100ml
· campurkan sebanyak 50.8ml larutan A dengan 49.2ml larutan B. uji dan betulkan pH
Ø Bahan biologi / Spesimen
· Slaid kaca yang telah di buat filem darah nipis dan dikeringkan.
Ø Alat Radas
· Pipet
· sisip kaca
· DPX
Ø Peralatan
· Pengering
· mikroskop
PROSEDUR :
1. Filem darah nipis dikeringkan pada udara.
2. Slaid dibanjirkan dengan pewarna leishman
3. Selepas 2 minit, air suling di tambah sebanyak 2x ganda. Dan
tiup perlahan-lahan untuk menyebatiakan campuran tadi.
4. Filem darah dibiarkan selama 10 – 15 minit
5. Pewarna tadi di basuhkan dengan pancutan air pili yang
perlahan dari satu penjuru supaya dapat mengeluarkan
keseluruhan ‘ metallic scum ’ daipada permukaan smear.
6. Belakang slaid dibilas dan dikeringkan.
PERBINCANGAN :
Ø Pewarnaan leishman adalah satu pewarnnaan yang mudah disediakan, cepat dan proses fixing dan pencelupan berlaku serentak. Hemaglobin dalam darah yang bersifat alkali akan di warnakan dengan warna eosin yang mempunyai pH berasid. Manakala nukleus sel darah putih yang bersifat akan diwarnakan dengan warna hematoksilinyang mempunyai pH beralkali.
Ø Smear darah yang diwarnakan dengan baik bewarna kemerahan unggu. Secara mikroskopinya, eritrosit akan kelihatan oren kemerahan ( eosin). Pada granul-granul pula iaitu bagi neutrofil – ungu, eosinofil – oren kemerahan, basofil – biru tua kehitaman. Bagi sitoplasma neutrofil – kemerahan pudar, limfosit – biru muda, monosit – biru keungguan. Bagi nukleus pula neutrofil – biru keungguan tua, limfosit – biru keungguan tua, monosit – biru keungguan muda. Manakala bagi platlet granul akan kelihatan merah keungguan di kelilingi biru.
Ø Sebaliknya, jika smear tidak dilakukan dengan baik sel darah merah akan nerwarna kebiruan dan nukleus berwarna biru tua tanpa struktur. Selian itu, sel darah merah akan terlalu kemerahan dan nukleus berwarna biru kelabu. Smear juga akan berwarna pudar dan terjadi pemendapan di atas sliad.
Ø Jika smear tidak diwarnakan dengan sempurna dan terjadi pemendapan, cara yang dapat memperbaiki ialah dengan melunturkan pewarna dengan methanol (absoluten methyl alcohol) diikuti dengan beberapa bilasan air dengan segera sehingga semua warna di keluarkan. Setelah semua warna di keluarkan semuanya, smear di warnakan semula dengan menggunakan pewarna yang sama.
Ø Dalam eksperimen ini, saya mendapati pewarnaan leishman pada filem darah nipis berjaya dilakukanini kerana smear darah kelihatan warna kemerahan keungguan. Dengan menggunakan mikroskop pada kuasa kanta X40. Didapati kelihatan sel darah merah, sel darah putih seperti limfosit, monosit, dan neutrofil.
KESIMPULAN :
Ø Pewarnaan leishmen berjaya dilakukan, dan sel – sel darah dapat dilihat di bawah mikroskop dengan sempurna dengan menepati keputusan yang dikehendaki.
SOALAN :
1. Mengapakah warna pewarna Leishman berwarna ungu ?
· Pewarna Leishman berwarna ungu kerana pewarna eosin berwarna merah bercampur dengan pewarna hematoksilin yang berwarna biru.
2. Bagaimanakah hendak membersihkan warna Leishman yang berlebihan pada slaid ?
· Warna Leishman yang berlebihan pada slaid dapat dibersihkan dengan melunturkan pewarna dengan metanol ( absolute methly alcohol ) diikuti dengan beberapa bilas air segera sehigga semua warna dikeluarkan.
SUMBER : Pelajar yang mengambil subjek ini.
